Год создания: 2004

Автор книги: Щелкунов С.Н.

Раздел медицины: Генетика

Ebook формат: DjVu

Качество книги: Отсканированные страницы

Краткое описание книги: Генетическая инженерия представляет собой удивительное явление в науке, когда разработка новой методологии дает мощный импульс развитию нашего понимания окружающей природы, ее сокровенных глубин. Бурному прогрессу генетической инженерии способствовало то, что уже в начале 1970-х гг., сразу после первых, еще робких экспериментов по рекомбинации in vitro негомологичных молекул ДНК, научной общественностью была осознана огромная важность и перспективность данной методологии. Это привлекло к ней широкие круги биохимиков, биологов, химиков и исследователей ряда других специальностей. Генно-инженерные эксперименты, выполненные в лабораториях разных стран, привели к такому фейерверку открытий, какого биологическая наука до тех пор не знала. В огромном потоке публикаций по генетической инженерии регулярно появляются работы, восхищающие дерзостью замысла и элегантностью методики.
Генно-инженерные исследования вносят уникальный вклад в изучение структурно-функциональной организации геномов различных организмов. Методология генетической инженерии постоянно совершенствуется, и все больше исследователей используют ее при решении самых разных задач биологической науки.
Методами генетической инженерии созданы штаммы бактерий, дрожжей, линии клеток, с высокой эффективностью продуцирующих биологически активные белки человека и животных. Это позволяет получать эукариотические полипептиды в огромных по сравнению с недавним прошлым количествах, что упрощает процедуру их очистки вплоть до индивидуального состояния. Работы по созданию штаммов-продуцентов имеют очень важное значение для медицины и ветеринарии и революционизируют бурно развивающуюся отрасль промышленности — биотехнологию. Чрезвычайно интересны исследования по созданию трансгенных животных и растений, содержащих и экспрессирующих чужеродную генетическую информацию.
Среди отечественной литературы имеется ряд обзорных материалов и монографий по различным разделам генетической инженерии. В то же время ощущается недостаток в учебной литературе, достаточно подробно и на современном уровне рассматривающей достижения, проблемы и перспективы развития данной области молекулярной биологии. В 1994 и 1997 гг. были изданы 1-я и 2-я части учебного пособия С.Н. Щелкунова «Генетическая инженерия», которое получило много положительных отзывов от научных сотрудников и преподавателей вузов. За прошедшие годы сформировались новые экспериментальные подходы, получен ряд принципиальных результатов, расширился спектр задач, решаемых методами генетической инженерии. В связи с этим возникла потребность в доработке и переиздании данного пособия.
В основу учебно-справочного пособия «Генетическая инженерия» положены лекции по генетической инженерии, которые автор читает в Новосибирском государственном университете начиная с 1980 г. Ссылки на большинство экспериментальных работ, выполненных до 1986 г., читатель сможет найти в монографиях С.Н. Щелкунова «Клонирование генов» и «Конструирование гибридных молекул ДНК» (Новосибирск: Наука, 1986, 1987). Раздел 1.12 написан известным специалистом в области химико-ферментативного синтеза генов А.Н. Синяковым.
Автор книги «Генетическая инженерия» является выпускником Новосибирского государственного университета и работает в области генетической инженерии с 1975 г. Первые генно-инженерные эксперименты выполнены им под руководством Н.И. Матвиенко и Л.П. Тихомировой в отделе академика А.А. Баева (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Путино). С 1976 г. он и его коллеги в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор», возглавляемом академиком Л.С. Сандахчиевым, выполнили многочисленные исследования с привлечением методов генетической инженерии на таких системах, как бактерии Escherichia coli, Bacillus subtilis, Agrobacterium tumifaciens, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, культивируемые клетки млекопитающих и насекомых. В качестве молекулярных векторов использовались различные плазмиды, космиды, колифаги лямбда и М13, вирусы осповакцины и эктромелии, а также бакуловирусы. Все это позволило автору четко охарактеризовать различные генно-инженерные системы, выделить их особенности, а также обрисовать перспективы развития многих направлений исследований в современной биологической науке.

---

Содержание книги
«Генетическая инженерия»

Общие принципы и методы генетической инженерии
Строение и свойства молекулы ДНК
Ферменты генетической инженерии

1. Рестриктазы
2. ДНК-лигаза
3. ДНК-полимераза I Е. coli
4. Обратная транскриптаза
5. Нуклеаза Ва131
6. Концевая дезоксинуклеотидил-транофсраза
7. Поли(А)-полимераза Е. coli

Методы конструирования гибридных молекул ДНК in vitro

1. Коннекторный метод
2. Рестриктазно-лигазный метод

Векторные молекулы ДНК
Введение молекул ДНК в клетки
Методы отбора гибридных клонов

1. Фенотипическая селекция
2. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ
3. Функциональная комплементация
4. Радиоиммуноанализ белков in situ

Расшифровка нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК

1. «Плюс-минус»-метод
2. Метод Сэнгера
3. Метод Максама-Гилберта
4. Автоматическое секвенирование ДНК
5. Базы данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
6. Геномные проекты

Амплификация последовательностей ДНК in vitro

1. Полимеразная цепная реакция
2. Примеры использования ПЦР

Блоттинг по Саузерну
Иммуноблоттинг
Разделение электрофорезом гигантских молекул ДНК
Методы химико-ферментативного синтеза двухцепочечньвсфрагментов ДНК

1. Метод Кораны
2. Конструирование ДНК-дуплексов из частично комплементарных полинуклеотидов
3. Конструирование искусственных генов из сверхдлинных полинуклеотидов
4. Использование для синтеза генов полимеразной цепной реакции

Векторная система грамотрицательной бактерии Escherichia coli
Введение плазмидных и фаговых молекул ДНК в клетки Е. coli

1. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий
2. Сферопласты
3. «Кальциевые» компетентные клетки
4. Электропорация
5. Упаковка ДНК фага лямбда в капсиды in vitro

Молекулярные векторы Е. coli

1. Клонирующие плазмидные векторы
2. Молекулярные векторы на основе ДНК фага лямбда
3. Космиды
4. Искусственные бактериальные хромосомы
5. Фазмиды
6. Клонирующие векторы на основе нитевидных фагов
7. Фагмиды
8. Векторные плазмиды, обеспечивающие прямой отбор гибридных ДНК
9. Векторы, обеспечивающие экспрессию чужеродных генов в клетках Е. coli
10. Векторы Е. coli, детерминирующие секрецию чужеродных белков

Достижение повышенной продукции белков, кодируемых генами, клонированными в клетках Escherichia coli
Эффект дозы гена при молекулярном клонировании
Влияние эффективности транскрипции клонированных генов на уровень их экспрессии
Повышение эффективности трансляции матричных РНК
Стабилизация чужеродных мРНК и белков в клетках Е. coli
Экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Escherichia coli
Сравнительный анализ организации и реализации генетической информации у прокариот и эукариот
Экспрессия хромосомных эукариотических генов в клетках Е. coli
Клонирование ДНК-копий эукариотических матричных РНК и их экспрессия в клетках Е. coli
Экспрессия в Е. coli химико-ферментативно синтезированных ген-эквивалентов эукариотических полипептидов
Конструирование штаммов — продуцентов первичных метаболитов на основе Escherichia coli
Направленный мутагенез молекул ДНК in vitro
Генно-инженерные делеции и вставки последовательностей ДНК
Статистический мутагенез гибридных ДНК
Сегмент-направленный мутагенез in vitro
Олигонуклеотид-направленный мутагенез in vitro
Белкован инженерии
Получение новых форм белков олигонуклеотид-направленным мутагенезом
Изучение доменной структуры белков
Создание белков с гибридными свойствами
Иммунотоксины
Фаговый дисплей

1. Принцип метода
2. Дептидные фаговые библиотеки
3. Фаговый дисплей белков
4. Направленная эволюция белков
5. Фаговый дисплей антител

Стабильность гибридных молекул ДНК в клетках Escherichia coli
Векторные системы грамотрицательиых бактерий, ие относящихся к роду Escherichia
Плазмиды широкого круга хозяев
Молекулярные векторы на основе плазмид группы несовместимости IncQ
Молекулярные векторы на основе плазмид группы несовместимости IncP
Использование векторов широкого круга хозяев для молекулярно-генетических исследований грамотрицательных бактерий
Бифункциональные (челночные) векторные плазмиды
Генно-инженерная система грамположительных бактерий рода Bacillus
Введение молекул ДНК в клетки Bacillus

1. Строение клеточной стенки грамположительных бактерий
2. Трансформация компетентных клеток
3. Универсальные методы введения плазмид
4. Трансфекция

Молекулярные векторы Bacillus

1. Клонирующие векторы на основе плазмид стафилококков и стрептококков
2. Векторы на основе плазмид Bacillus
3. Векторные плазмиды, реплицирующиеся в В. subtilis ив? coli
4. Векторная система секреции чужеродных белков из клеток Bacillus
5. Плазмидные интегративные векторы
6. Фаговые векторы

Экспрессия чужеродных генов в клетках Bacillus

1. Особенности строения и экспрессии генов грамположительных бактерий
2. Оптимизация экспрессии клонированных генов

Стабильность плазмид в клетках В. subtilis
Генно-инженерные системы грамположительных бактерий, не относящихся к роду Bacillus
Бактерии рода Streptococcus
Бактерии рода Streptomyces
Коринеформные бактерии
Некоторые проблемы, возникающие при синтезе в бактериях эукариотических белков
Генно-инженериая система дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Генетическая организация дрожжей-сахаромицетов
Плазмиды 5. cerevisiae
Плазмидная трансформация клеток дрожжей
Молекулярные векторы 5. cerevisiae

1. Векторы интеграции
2. Клонирующие векторы
3. Стабильные молекулярные векторы
4. Линейные молекулярные векторы

Клонирование генов в клетках S. cerevisiae

1. Экспрессирующие векторные системы 5. cerevisiae
2. Секреция чужеродных белков из клеток 5. cerevisiae
3. Продукция чужеродных белков в S. cetevisiae
4. Двухгибридная система дрожжей для идентификации белок-белковых взаимодействий

Генетическая инженерия культивируемых клеток млекопитающих
Введение молекул ДНК в клетки млекопитающих

1. Введение вирусных ДНК
2. Введение плазмид и фрагментов ДНК

Стабильность гибридных молекул ДНК в культивируемых клетках млекопитающих
Генетическая трансформация клеток млекопитающих

1. Генетическая трансформация мутантних линий
2. Котрансформация
3. Доминантные амплифицируемые маркеры генетической трансформации
4. Эписомные векторы генетической трансформации
5. Регулируемая экспрессия целевых генов

Векторные системы на основе вирусов животных
Вирус SV40 как молекулярный вектор

1. Структурно-функциональная организация генома SV40
2. Литические векторы на основе ДНК вируса SV40
3. Нелитические эписомные векторы на основе генетических элементов SV40
4. Трансформирующие векторы на основе SV40
5. Особенности экспрессии клонированных последовательностей в составе генома SV40

Молекулярные векторы на основе генома вируса папилломы быка
Аденовирусы в качестве молекулярных векторов

1. Молекулярно-генетическая организация Ad2 и Ad5 человека
2. Конструирование гибридных аденовирусов
3. Рекомбинантные аденовирусные вакцины
4. Генная терапия

Молекулярные векторы на основе вирусов семейства Herpesviridae

1. Конструирование in vivo гибридных вирусов простого герпеса
2. Разработка живых вакцин на основе герпесвирусов животных
3. HSV-ампликоны
4. Плазмидные векторы на основе элементов генома вируса Эпштейна-Барр

Экспрессирующие векторы на основе поксвирусов

1. 14.5.1. Структура вириона и генома ортопоксвирусов
2. 14.5.2. Конструирование гибридных вирусов осповакцины
3. 14.5.3. Использование гибридных поксвирусов для вакцинации домашних и диких животных

14.6. Трансдукция генов с помощью ретровирусов

1. Молекулярно-генетическая организация ретровирусов
2. Ретровирусные молекулярные векторы
3. Генетическая нестабильность гибридных ретровирусов
4. Ретровирусы в качестве инструмента генной терапии

Вирусы насекомых как векторы высокоэффективной экспрессии чужеродных генов
Молекулярно-генетическая организация бакуловирусов
Клонирование и экспрессия чужеродных генов в составе генома бакуловирусов
Упрощенная система создания гибридных бакуловирусов Bac-to-Bac
Векторная система иа основе транспозонов эукариот
Противовирусные вакцины
Цельновирионные вакцины
Вакцины на основе вирусных антигенов
Генно-инженерные поливалентные живые вакцины
ДНК-вакцины
Вакцины против вируса иммунодефицита человека

1. Пандемия СПИДа
2. Тестирование HIV-инфекции
3. Стадии развития HIV-инфекции
4. Варианты вакцин против вируса иммунодефицита человека

Трансгенные животные
Получение трансгенных животных

1. Клетки тератокарциномы мыши
2. Микроинъекция ооцитов
3. Эмбриональные стволовые клетки
4. Ретровирусы

Экспрессия генов в трансгенных мышах
Трансгенные животные в фундаментальных исследованиях

1. Нокаутные мыши
2. Регулируемое включение-выключение генов in vivo

Биотехнологическое применение трансгенных животных
Трансгенные растения
Перенос генов в растения из бактерий рода Agrobacterium
Использование плазмид Ті A. tumefaciens для создания трансгенных растений
Получение трансгенных растений с помощью бинарной векторной системы A. tumefaciens
Экспрессия и наследование чужеродных генов, введенных в растения в составе Т-ДНК
Прямой метод введения трансгена в растения
Синтез в растениях чужеродных белков медицинского назначения

1. Терапевтические и диагностические антитела
2. Съедобные вакцины

Перенос генов в растения с помощью вирусов
Трансгенная система хлоропластов
Белковый сплайсинг в трансгенных растениях

1. Удаление маркерных генов из трансгенных растений
2. Трансгенные растения с новыми биотехнологическими свойствами
3. Трансгенные растения в сельском хозяйстве

Литература